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南京信帆生物:IPTG誘導蛋白表達的原理及方法步驟
更新時間:2016-04-20   點擊次數:1196次

E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結合,使操縱子(元)受阻遏而處于關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區,三個酶的編碼基因即由同一調控區調節,實現基因產物的協調表達 。在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子(元)即可被誘導。在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經b-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用*的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,因此被實驗室廣泛應用。

材料

1、誘導表達材料

( 1 ) LB (Luria―Bertani))培養基

酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用范圍:大腸桿菌(Escherichia coli)

( 2 ) IPTG 貯備液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,分裝成1 mL /份,-20 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液:

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (電泳級)

0.1 % 溴酚藍

10 % 甘油

2、大腸桿菌(Escherichia coli)包涵體的分離與蛋白純化材料

1 )酶溶法

(1)裂解緩沖液:

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。

(3)10 mg / mL 溶菌酶。

(4)脫氧膽酸。

(5)1 mg / mL DNase I。

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